Allosteric regulation and functional dynamics of CRY1 in the mammalian circadian clock : insights from mutationak and small molecule interactions

Abstract

Cryptochromes (CRYs) are essential components of the molecular clock that governs circadian rhythms in mammals, functioning as inhibitors of BMAL1/CLOCK-driven transcription. While mammals possess two CRYs with distinct roles in the circadian clock, the mechanisms underlying their differential functions remain unclear. This study elucidates how a specific mutation in CRY1 allosterically alters its dynamic behavior. Molecular dynamics simulations were conducted on eight CRY1 mutants experimentally shown to exhibit reduced repressor activity. My findings reveal that mutations in CRY1 affect the dynamic behavior of the serine loop and the accessibility of the secondary pocket, changes not observed in CRY2. Further analysis highlights that the flexibility of the serine loop influences secondary pocket volume, with S44 and S45 playing crucial roles through their interactions with E382. Additionally, I explored the potential for small molecules to modulate CRY1 allosterically, demonstrating both in silico and in vitro that this regulation impacts CRY1's affinity to CLOCK. This discovery provides a promising avenue for developing therapeutics targeting CRY1, though it also raises concerns about unforeseen side effects of existing small molecules. To address this, virtual screening was performed to identify compounds targeting the CRY1 secondary pocket. Subsequent phenotypic analysis revealed five distinct effects on circadian rhythm, underscoring the complexity of this regulatory mechanism. This study offers critical insights into CRY1 dynamics, its interaction with CLOCK, and the potential for small-molecule modulation, paving the way for advancements in circadian biology and drug design.

Kriptokromlar (CRY'ler), memelilerde sirkadiyen ritimleri yöneten moleküler saatin temel bileşenleridir ve BMAL1/CLOCK tarafından yönlendirilen transkripsiyonun inhibitörleri olarak işlev görürler. Memeliler sirkadiyen saatte farklı rollere sahip iki CRY'ye sahip olsalar da, farklı işlevlerinin altında yatan mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Bu çalışma, CRY1'deki belirli bir mutasyonun dinamik davranışını allosterik olarak nasıl değiştirdiğini açıklamaktadır. Deneysel olarak azaltılmış represör aktivitesi gösterdiği gösterilen sekiz CRY1 mutantı üzerinde moleküler dinamik simülasyonları yürütülmüştür. Bulgularım, CRY1'deki mutasyonların serin döngüsünün dinamik davranışını ve ikincil cebin erişilebilirliğini etkilediğini, CRY2'de gözlemlenmeyen değişiklikleri ortaya koymaktadır. Daha ileri analizler, serin döngüsünün esnekliğinin ikincil cep hacmini etkilediğini, S44 ve S45'in E382 ile etkileşimleri yoluyla önemli roller oynadığını vurgulamaktadır. Ek olarak, küçük moleküllerin CRY1'i allosterik olarak modüle etme potansiyelini araştırdım ve hem silico hem de in vitro olarak bu düzenlemenin CRY1'in CLOCK'a olan afinitesini etkilediğini gösterdim. Bu keşif, CRY1'i hedef alan terapötikler geliştirmek için umut verici bir yol sağlıyor, ancak aynı zamanda mevcut küçük moleküllerin öngörülemeyen yan etkileri konusunda endişeleri de artırıyor. Bunu ele almak için, CRY1 ikincil cebini hedef alan bileşikleri belirlemek için sanal tarama yapıldı. Daha sonraki fenotipik analiz, sirkadiyen ritim üzerinde beş farklı etki ortaya koyarak bu düzenleyici mekanizmanın karmaşıklığını vurguluyor. Bu çalışma, CRY1 dinamikleri, CLOCK ile etkileşimi ve küçük molekül modülasyonu potansiyeli hakkında kritik içgörüler sunarak sirkadiyen biyoloji ve ilaç tasarımında ilerlemeler için yol açıyor.